Вирус мешотчатого расплода - вирусная болезнь пчел
Мешотчатый расплод — одна из распространенных вирусных болезней пчел, которая регистрируется на всех континентах (М.Аubert, В.Вall et al., 2008). Сведения по мешотчатому расплоду в СССР были известны еще в первой половине прошлого века. По результатам исследований патологического
материала, поступающего во ВНИИ экспериментальной ветеринарии, вирус мешотчатого расплода является наиболее частой причиной гибели пчелиного расплода на пасеках многих регионов, в том числе крупных пчелоразведенческих хозяйств («Пчеловодство» 2010, №10). В настоящей работе приведены новые сведения о клинических признаках болезни и новые данные по генетическим особенностям ее возбудителя.
В справочниках по болезням пчел обычно приводят классические признаки мешотчатого расплода, то есть погибшие личинки пчел в виде мешочков, Заполненных жидкостью. Однако обнаружить таких личинок можно только в случае тяжелого протекания болезни. Часто в семьях пчел, неблагополучных по мешотчатому расплоду, найти больных и погибших личинок почти невозможно. Пчелы безошибочно обнаруживают их и оперативно удаляют из улья,
Специалист по болезням пчел LВailey (Англия) проводил эксперименты по инкубации печатного расплода в термостате при отсутствии взрослых пчел. Был использован расплод из разных семей пасеки, неблагополучной по мешотчатому расплоду. Установлено, что до 6% личинок могут погибать от этого вируса даже в семьях, которые казались абсолютно здоровыми. Таким образом, при невысокой степени поражения болезнь может оставаться незамеченной.
Известно, что кроме личинок рабочих пчел вирус поражает личинок трутней. Нами отмечено, что пчелы менее оперативно удаляют погибших личинок трутней (видимо, из-за более тяжелого веса), а погибших куколок трутней часто разгрызают и выбрасывают по частям. Гибель личинок рабочих особей и трутней происходит после их запечатывания. Пчелы распознают ячейки с погибшими личинками и вскрынанот их.
В норме открытые личинки лежат колечком на дне ячейки. Только после запечатывания они вытягиваются и начинают прясть кокон. Вытянувшиеся личинки в открытых ячейках указывают на патологию (рис. 1).
Рис. I. Трутневый расплод, пораженный вирусом
У пчеловодов выбрасывание личинок и куколок трутней обычно не вызывает особой тревоги. Однако в разгар сезона выбрасывание трутневого расплода указывает на болезнь. Скорее всего, то же самое происходит и с личинками рабочих особей, но менее заметно.
Иногда личинки, зараженные вирусом мешотчатого расплода, не погибают на стадии прядения кокона, переходят в стадию предкуколки и долго остаются живыми. У них не накапливается жидкость под личиночной кутикулой. Внешне они выглядят нормально и на первый взгляд непонятно, почему пчелы вскрывают их ячейки. Однако у некоторых предкуколок сквозь личиночную кутикулу можно увидеть пигментированные глаза (рис. 2). В норме у личинокнет органов зрения. Зачатки конечностей и глаза появляются у предкуколок под личиночной кутикулой, но они
Рис. 2. Здоровая личинка (a); предкуколка с пигментированными глазами, пораженная вирусом (б)
белые. Даже после завершения стадии предкуколки, сбрасывания личиночной кутикулы и образования куколки ее тело некоторое время лишено пигментации. В доступной литературе мы не нашли сведений о том, что на стадии
предкуколки может происходить пигментация глаз.
Для выявления в личинках и предкуколках вируса мешотчатого расплода использовали реакцию иммунодиффузии (РИД). Эта серологическая реакция для идентификации вирусов пчел была впервые использована LВalley. Результаты нашей работы показали, что предкуколки с пигментированными глазами содержат вирус в большом количестве. Следовательно, вирус мешотчатого расплода даже при интенсивном размножении в некоторых случаях не затрагивает жизненно важных органов. Предкуколка долго остается живой, но ее метаморфоз нарушается. В вышеприведенном примере практически все органы (кроме глаз) прекращают свое развитие. В других случаях куколка все же образуется, но с явными уродствами (нарушены пропорции между головой, грудью и брюшком, отсутствуют конечности), Куколка, пораженная вирусом, может не иметь никаких внешних дефектов. Таким образом, вирус мешотчатого расплода вызывает гибель не только личинок старшего возраста, но и предкуколок и куколок. Пчелы старше 8 дней невосприимчивы к вирусу мешотчатого расплода. Более молодые пчелы могут заражаться, и тогда они становятся вирусоносителями, какие-либо видимые симптомы болезни у них отсутствуют, но нарушается функция сбора пыльцы и сокращается продолжительность жизни.
В 1960—1970-е гг. LВailey с помощью РИД исследовал большое число образцов личинок европейской пчелы А. meliffeга, собранных в разных странах, и не выявил серологических различий между обнаруженными в них изолятами вируса мешотчатого расплода. Вирус с небольшими отличиями физико-химических и серологических свойств был выделен LВailey et al. в 1982 г. от погибших личинок азиатской пчелы Apis cerапа, привезенных из Таиланда, и назван тайским вирусом мешотчатого расплода. В тот период тайский вирус мешотчатого расплода был широко распространен в семьях А сегапа в Таиланде, Бирме, Индии и Непале, где вызывал массовую гибель пчелиных семей до 90-95%.
Ареалы европейских и азиатских пчел на протяжении многих тысяч лет не совпадали.
Массовый завоз европейских пчел в ареал азиатских произошел в прошлом веке. По отдельным сведениям, первые случаи интродукции пчел датируются более ранним периодом например, в Японию европейскую пчелу впервые завезли в 1877 г. (У Кolima et al., 2011). Пчел этих двух видов местные пчеловоды часто содержали на одних и тех же пасеках, где возможно и произошел переход некоторых - возбудителей болезней с одного вида пчел на другой с дальнейшей адаптацией к новому хозяину. С вирусом мешотчатого расплода этого не произошло. В лабораторных условиях LВalley удалось заразить куколок европейской пчелы вирусом тайского мешотчатого расплода. Однако в естественных условиях для этого вируса, скорее всего, существует видовой барьер (Y.Коjіппа et al., 2011: Sе-Ешп Choe et al., 2011): у каждого вида пчел цирку- лирует только свой вирус.
По данным филогенетических исследований области РНК-полимеразы вирусов мешотчатого расплода, изолированных в разных географических местах и от разных видов пчел, выделяют три генотипа: южноафриканский, европейский и азиатский" (3).
Что представляют собой штаммы вируса - мешотчатого расплода, циркулирующие среди пчел на территории России, до недавнего времени оставалось неизвестным. Это и побудило нас провести исследования на мо- o лекулярно-генетическом уровне материала, в котором ранее методом РИД установили вирус мешотчатого расплода. Материал был собран в разные годы напасеках Краснодарского края (район Кисловодска), Республики - Адыгея (Майкоп), Калужской, Оренбургской, Архангельской и Московской областей (в том числе от семей пчел, завезенных из Узбекистана) и хранился в замороженном или лиофилизированном виде. Исследовали также - лабораторный штамм Tr5 вируса мешотчатого расплода, культивируемый на куколках пчел и трутней методом микроинъекции. Идентификацию вируса проводили методами РИД и ПЦР (полимеразная цепная реакция). В РИД использовали сыворотки собственного производства, которые были получены иммунизацией кроликов вирионами, выделенными из погибших личинок с клиническими признака- - ми мешотчатого расплода из Калужской области (сыворотка No.6), и вирионами, выделен- - ными из погибших пчел с деформированными крыльями из Таджикистана (сыворотка No58).
Образцы сывороток были отправлены в Великобританию (Нothапsteci Ехреriпепtal Station, Harpenden, Hertfordshire, UK), role WX тестировала доктор Вrепda V. Вall в РИД с разными вирусами пчел. Сыворотка No.6 давала положительный результат только с эталонным штаммом Rothamstead вируса мешотчатого расплода" (титр антител 1:12В). Сыворотка No58 не реагировала с этим штаммом, но реагировала с вирусом деформации крыльев (титр антител 1:64).
В ПЦР материал исследовали со специфическими праймерами к вирусам мешотчатоro pacплода (Teritcheva, 2004; Grabensteiner, 2001), деформации крыльев (Мacri, 2007; Вегепуi, 2006), острого паралича (Tentcheva, 2004), Kaumwip (Stoltz et al., 1995, Maori, 2007), черных маточников (Маоп, 2007).
Во всех исследованных образцах подтверждено наличие вируса мешотчатого расплода. В двух пробах выявили присутствие одновременно двух вирусов: мешотчатого расплода и деформации крыльев. Никакие другие вирусы из вышеперечисленных в исследованных пробах не обнаружено.
Для трех изолятов и лабораторного штамма вируса мешотчатого расплода была определена первичная структура фрагмента РНКполимеразы (последовательности зарегистрированы в международной базе данных Généank non homepam JN83572–JN83575) и проведен филогенетический анализ. На филограмме (рис. 3) можно выделить четыре группы, или генотипа, из которых группы 1-3 были впервые описаны Grabепsteіпer et al. (2001). Европейский генотип (группа 1) с эталонным штаммом из Великобритании объединяет вирусы Центральной Европы (Германия, Франция, Австрия, Венгрия, Испания) и Великобритании. В этой же группе вирусов оказались изоляты 207/4 и 212/3, выделенные в России (Московская обл. и Кисловодск соответственно), гомология между которыми составляет 99%. Ближайшие их родственники присутствуют в Германии и Франции.
К азиатскому генотипу (группа 2) принадлежат вирусы из Южной Кореи, Китая, Непала, Индии и Японии. Среди них находится и тайский вирус мешотчатого расплода Южноафриканский генотип (группа 3) представлен одним изолятом из Южной Африки.
На обособленной ветви (группа 4) оказались два наших изолята: лабораторный штамм Tr5 и изолят 202/8, выделенный из семьи пчел, завезенной из Узбекистана. Гомология между ними составляет 94,2%, в то время как с представителями других групп она не превышает 80,6–83,5%.
Генетическое расстояние в пределах одной группы колеблется от 1% (группа 2) до 6% (группы 1 и 4), а между группами от 10% (группы 1 и 2) до 25—28% (группы 3 и 4). На этом основании группа 4 может быть выделена в самостоятельный генотип.
Исследуемые в настоящей работе изоляты генетических групп 1 и 4 вируса мешотчатого расплода по-разному вели себя в РИД с сыворотками No 6 и 58. Все изоляты геногрупп 1 и 4 положительно реагировали с сывороткой No6, подобно эталонному штамму Rothапstead (Великобритания) вируса мешотчатого расплода европейского генотипа. С сывороткой No58 положительно реагировали только изоляты геногруппы 4 вируса мешотчатого расплода и изоляты вируса деформации крыльев. В перекрестной реакции между вирусом мешотчатого расплода геногруппы 4 и вирусом деформации крыльев серологического родства не выявлено. Таким образом, в наших экспериментах было установлено, что сыворотка No58 содержит антитела не только к вирусу деформации крыльев в титре 1:64, но и к вирусу мешотчатого расплода генотипа 4 в титре 1:В. С вирусом мешотчатого расплода европейского генотипа (группа 1) реакция отсутствовала, что согласуется с данными В.М.Ван. По всей видимости, материал из Таджикистана, который использовали для получения сыворотки No58, содержал два морфологически схожих вируса: деформации крыльев и мешотчатого расплода генотипа 4.
На основании проведенных исследований можно сделать вывод о существовании двух генотипов вируса мешотчатого расплода у пчел А. пеlliferа на территории Российской Федерации. Один из них принадлежит европейской группе. Второй образует самостоятельную группу 4, ранее никем не описанную, занимающую промежуточное положение между вирусами азиатского (группа 2) и южноафриканского (группа 3) генотипов
Источником вируса мешотчатого расплода генотипа 4 в одном случае была семья пчел из Узбекистана (изолят 202/8), в другом (материал, используемый для иммунизации) — из Таджикистана (сыворотка No58). Тем не менее мы воздерживаемся от присвоения генотипy 4 вируса мешотчатого расплода названия по территориальному признаку (например, среднеазиатский), поскольку слишком мало данных имеется о его распространении. Подробную информацию о материалах и методах наших исследований можно найти в ж-ле «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» (2012, No3).
Ю.М. Батуев Н.Ф. Ломакин
ВНИИ экспериментальной ветеринарии
Литература
I. Батуев ГО М Мешотчатый расплод // Пчеловодстно. — 2010 — No.10. –
2. Ломакина НФ, Батуев Ю.М. //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология,—2012. — No.3,
3. Grahersfeirer E., Riffer H", Carrer M." er fil. // Clin. Diagn. Lab. Iirimunol. – 2001 W8 (1).
Смотрите так же
Вирус деформации крыла
Вирус острого паралича
Вирус хронического паралича
Вирус мешотчатого расплода
Вирус черных маточников
Кашмирский вирус
