ДНК - тестирование пчел украинской степной и карпатской пород
Плодородные почвы Украины, богатая медоносная растительность и соответствующие климатические условия способствовали размножению пчел и сбору большого количества меда. В течение длительного эволюционного развития происходил естественный процесс создания аборигенных пчел, которые хорошо приспосабливались к местным условиям климата и медосбора [9]. На территории Украины сформировались и в настоящее время районированы украинская степная и карпатская породы, а также полесская популяция среднерусской пчелы [10].
Украинские степные пчелы является самой распространенной породой в нашей стране и относятся к группе аборигенных пчел европейского происхождения, занимая Лесостепь и степную зоны. Их ареал на Западе охватывает часть приграничных районов Молдавии и доходит до Карпат. На Севере украинская пчела граничит с полесской популяцией среднерусской породы. Восточная часть ареала украинских степных пчел представлена рядом соседних с Украиной районов Российской Федерации. Во второй половине XIX века произошел массовый завоз их из природного ареала на широкие просторы Приморского края и губерний Восточной Сибири Российской империи [2]. Как свидетельствуют научные данные, пчелы украинского происхождения во многих районах сохранили свои породные особенности и в условиях богатой медоносной базы дают рекордные сборы меда.
Генетический потенциал украинской степной пчелы богат. По словам "Научные доклады НАУ" 2005-1 (1) http://www.nbuv.gov.ua/e-Journals/nd/2005-1/05gvaacb.pdf 2 В.А. Нестерводского [8] наша пчела хорошая и достойна внимания. Обследовав пасеки на Подолье, Уманщине, Харьковской, он отмечает, что украинская пчела живая, энергичная, трудолюбивая, мало роится по сравнению с южной, далеко летает за пищей и поэтому продуктивнее. Она очень осторожно вылетает, поэтому ее мало теряется и семьи не выбиваются из сил в холодное время. Вощину строит хорошо, мед закрывает ровной, белой как снег крышкой, поэтому сотовый мед имеет прекрасный вид.
Матки очень плодовиты и расплод в них непрерывный, поэтому семьи быстро становятся сильными и отпускают ранние рои.
Карпатские пчелы естественно занимают горные и предгорные районы Западной Украины. К наиболее типичным представителям, которые отличаются рядом ценных биологических особенностей и хозяйственно-полезных признаков, относятся пчелы высокогорных районов Закарпатья, которые приспособлены к условиям зимовки с длительным безоблетным периодом. По экстерьеру они близки к краинским пчелам, но отличаются от них высокой зимостойкостью, меньшей пораженность нозематозом и другими этологическими признаками [4]. Поэтому карпатских пчел начали завозить в другие области Украины. Начатое А. Аветисян [3] углубленное изучение и селекция карпатских пчел завершилось созданием в породе популяций, экотипов, линий.
На украинскую степную породу пчел, к сожалению, негативно повлияли семьи и матки других пород. Начиная с 1944-1945 годов, в Украине для восстановления разрушенного войной пчеловодства массово завозили пчел с Кавказа и другого происхождения, в том числе и серой горной кавказской породы. На многих пасеках состоялось скрещивание местных пчел и возникли помеси разных поколений.
Как массовый, так и одиночный завоз пчелиных маток и семей других пород при низком уровне селекционной работы привело к уничтожению ценных местных популяций. Поместные пчелы снизили производительность, стали более чувствительными к возбудителям болезней и других факторов среды. В этих условиях увеличивается значение систематической племенной работы с районированными породами пчел как на товарных пасеках, так и в специализированных племенных хозяйствах. Для сохранения местных пород пчел необходимо применять на пасеках Украины чистопородное разведение. Важное значение в этом имеет отбор селекционного материала, организация репродукции чистопородных пчел, создание внутрипородного типов.
Сейчас принадлежность пчел к той или иной породе определяют преимущественно за фенотипическими признаками (экстерьерных, физиологическими, Этологические) и показателями хозяйственной ценности. Они широко варьируют даже в пределах одной породы или популяции, поскольку зависят от географического размещения пчел, их возраста и питания [2]. Кроме того, большую роль в определении признаков породы играет квалификация специалиста. Поэтому возникла острая необходимость в разработке определенных мер на установление и сохранение биологического чистоты пород пчел. Это крайне важно как для практической генетико-селекционной работы, так и для генетико-популяционных и филогенетических исследований.
В 1989 О.В. Капралова, Л.В. Дубовая [7] разработали цитогенетический метод изучения ДНК в ядрах клеток гемолимфы различных стаз пчел. Результаты исследований показали, что существует достоверная разница по особенностям ДНК в ядрах клеток гемолимфы разных пород пчел на некоторых этапах онтогенеза. На основе полученных результатов было предложено в практической работе для характеристики породы рядом с общепринятой методикой морфометрии пользоваться цитофотометричним методом исследования породной принадлежности пчел.
Геном пчел остается мало исследован, построена лишь приблизительная генетическая карта [12]. Все это свидетельствует об актуальности изучения генотипа разных пород пчел с использованием методов молекулярной генетики.
Одним из прогрессивных, по сравнению быстрых и менее трудоемких является RAPD-анализ (random amplified polymorphic DNA) [13] генетического полиморфизма пчел. Это модифицированный метод полимеразной цепной реакции с использованием коротких фрагментов ДНК, генетически специфические исследуемой ДНК. Суть метода заключается в том, что в роли праймера (последовательность ДНК с 8-12 пар нуклеотидов) используется произвольный нуклеотид, который способен гибридизироватся с исследуемой ДНК и амплифицировать (увеличивать копии) ее [5].
RAPD-технология используется при изучении генома, популяций, типов, маркировке признаков [6]. В пчеловодстве ДНК-тестирование недостаточно разработано и используется мало. Относительно украинских и карпатских пчел этот метод идентификации пород не применяли.
Цель исследований - провести ДНК-тестирование пчел украинской степной и карпатской пород на чистопородных семьях, отобранных по экстерьерным и иным признакам.
Материал и методика исследований. В опытах использовали пробы пчел из семей, принадлежащих к племенному материалу, созданного в результате многолетней селекционной работы с карпатской и украинской степной породами.
Исследуемые пчелы украинской породы относятся к хмельницкому внутрипородному типу, созданному кафедрой пчеловодства им. В.А. Нестерводского ("Прибужские медоборы" с. Головченци, Хмельницкой области). Образцы пчел карпатской породы отобраны из отселекционированых семей пасеки отдела селекции и репродукции пчел карпатской породы Института пчеловодства им. П.И. Прокоповича УААН (с. Вучково Закарпатской области).
Пчелы семей хмельницкого внутрипородного типа по экстерьерных признакам полностью соответствуют требованиям украинской степной породы - длина хоботка у них в среднем равна 6,41 мм, показатели кубитального индекса - 2,27, дискоидальное смещения - положительное 79%, выпуклая форма заднего края воскового зеркальца пятого стернита наблюдаются у 90% пчел. Эти данные являются результатом компьютерной обработки промеров экстерьера пчел около 400 семей, исследованных за последние пять лет на завершающем этапе создания типа. Он структурирован на девять генеалогических групп, каждая из которых представляет совокупность семей общего происхождения с матками разных поколений, потомки отобранных родоначальниц.
Отобранные и законсервированы в соответствии с требованиями методики пробы пчел были направлены для ДНК-тестирование (г.. Москва). Лабораторные анализы выполнены А.Б. Абрамовой и А.С. Чудиновым по специальному заказу.
Поскольку настоящее название исследуемых пород является дискуссионной, пчел украинской породы из подопытных семей хмельницкого внутрипородного типа условно обозначили как украинские степные (Apis mellifera acervorum), а отобранные из семей пасеки отдела селекции и репродукции карпатских пчел Института пчеловодства им. П.И. Прокоповича - карпатские (Apis mellifera carpatica).
Анализ проводили по методу RAPD-праймеров - локальной амплификации набора фрагментов ДНК размером от 50 до 2500 пар нуклеотидов, франкованих короткими инвертированными повторами, которые выступают как участки выжигание для случайно подобранного 10-нуклеотидного праймера.
Распределение в геноме инвертированных повторов является уникальным, что позволяет выявлять различия в RAPD-фингерпринтах различных видов и пород.
Для дифференциации пород пчел подобрано породоспецифичные маркеры. В результате RAPD-амплификации образуется набор фрагментов ДНК различной массы, который при делении на ФОРЕЗ дает уникальный фингерпринт, где каждый полиморфный между видами или внутривидовой фрагмент ДНК проявляется в роли видоспецифического или породоспецифичного маркера. Поэтому подбор маркеров, которые дифференцируют породы в RAPD-анализе заключается в выявлении эффективных праймеров длиной 10 нуклеотидов.
Для проведения RAPD-анализа использовалась тДНК-образцов рабочих пчел, предназначенных для исследований. Выделение тотальной ДНК проводилось методом SDS-лизиса с последующей фенол-Хлороформный экстракции. После выделения и очистки ДНК-образцов определяли концентрацию, степень чистоты и степень фрагментации ДНК.
Степень фрагментации тДНК-образцов рабочих пчел проводили методом электрофореза в 0,8% -ном аграрном гели. Степень чистоты и концентрацию препарата тДНК-образцов определяли с помощью измерения оптического поглощения препаратов тДНК на длине волн 260 и 280 нм.
Локальная амплификация при полимеразной цепной реакции с использованием RAPD-праймеров проводилась по методике, предложенной для изучения генетического полиморфизма ДНК-генома различных пород пчел [11]. В исследованиях использованы синтетические 10-членные олигонуклеотиды, последовательность которых отвечала праймеры, разработанным компанией "Operon" (США). ПЦР-продукты разделяли в 6% -ном полиакриламидном (ПААГ) геле. После проведения электрофореза ПААГ или аграрный гель окрашивали бромистым этидием. Для визуализации картины распределения фракций ДНК после RAPD-амплификации использовали УФ-Трансиллюминатор.
Фотоотпечаток по результатам опытов получали с помощью гельдокументуючои системы "Kodak".
Результаты исследований. На рисунке представлен результат электрофоретического распределения фракций ПЦР-продукта образцов исследованных пчел после локальной амплификации с использованием праймера В15. Праймер В15, как и испытан в опытах В06, оказался эффективным для идентификации породной принадлежности пчел обеих пород. Слева под условным названием Apis mellifera acervorum показано воспроизведения ДНК-фингерпринтив образцов пчел украинской породы, справа - карпатской (Apis mellifera carpatica).
Как показывает фотоотпечаток, ДНК-маркеры, обозначенные символами СА1, Са2, Са3, СА4, обнаруженные во всех фингерпринтах пчел карпатской и отсутствовали у пчел украинской породы. Эти ДНК-маркеры четко различают исследуемых пчел и пригодны для идентификации пчелиных семей украинской и карпатской пород, проявляя хорошую воспроизводимость ДНК-фингерпринтив.
Важной особенностью результатов ДНК-тестирование пчел, как видно из рисунка, является высокая генетическая однородность исследуемых семей в пределах породы.
Сравнение результатов исследований на генетическую дактилоскопию показало не только хорошо выражены породные различия украинских и карпатских пчел, но и отсутствие в них признаков серой горной кавказской и среднерусской пород, исследованных ранее в лаборатории.
Рис. Результат электрофоретического разделения продуктов
RAPD-ампфликации с праймером В15 в 6% ПААГ образцов пчел
Украинской степной и карпатской пород
Установленная в наших опытах видовая специфичность генома пчел, отобранных в типичных условиях ареала их обитания (Карпаты и Лесостепь Украины), дает основание утверждать о принадлежности карпатских и украинских пчел к разным породам, которые характеризуются своими особенностями по признакам экстерьера, поведения, приспособленности к сбора корма, устойчивости против воздействия факторов среды.
Полученные нами данные о характеристиках исследуемых пород указывают на необходимость анализа результатов по изучению истории их формирования, методов разведения, селекции, районирования при современном хозяйственном использовании и сохранения в чистоте в своем естественном ареале.
Привлекает внимание, в частности, тот факт, что генетическая однородность пчел хмельницкого внутрипородного типа, который состоит из девяти генеалогических групп, совпадает с признаками консолидации по результатам изучения промеров экстерьера. Так, межгрупповые колебания средней длины хоботка составляют 6,34-6,63 мм, кубитального индекса - 2,18-2,62, дискоидальное смещения - 72-94% положительных случаев, выпуклая форма заднего края воскового зеркальца пятого стернита - 64 -96%.
Селекция пчел методом чистопородного разведения с одновременным распределением отобранного материала на генеалогические группы с использованием основных породных признаков экстерьера для постоянного контроля принадлежности семей в украинской породы подтверждена методом выявления ДНК-маркеров.
Отсутствие у них признаков других пород указывает на возможность содержания чистопородных семей в ячейках полузакрытой популяции и достаточную эффективность их использования и контроля качества материнской группы по признакам экстерьера пчел.
Выводы. Проведенный анализ показал, что пчелы украинской степной породы по результатам ДНК-тестирования отличаются от пчел горных районов Карпат, им присущи свои генетические различия.
В рамках породы исследуемые пчелы характеризуются высокой однородностью и хорошо дифференцируются с помощью установленных ДНК-маркеров.
В. А. Гайдар, кандидат сельскохозяйственных наук,
Институт пчеловодства им. П.И. Прокоповича УААН
В. П. Полищук, доктор сельскохозяйственных наук,
И. И. Головецкий, ассистент
Национальный аграрный университет
Смотрите также
